景杰生物 | 报道
以蛙为代表的越冬两栖动物，如何度过长达数月的低温时期是一个很有趣的科学问题。冬眠是这些动物应对长时间寒冷和食物供应不足时采取的一种生存策略。在此期间，动物通过降低自身代谢速率，减缓内源性能量的消耗，从而延长生存时间。为在低代谢条件下长期生存，动物必须维持基础生命的功能，提高防御能力，同时还要保证复苏时许多生命过程的快速恢复，因此，冬眠期间的代谢抑制受到可逆的调控。其中，最典型的就是可逆的蛋白质磷酸化(RPP)，该过程消耗的三磷酸腺苷(ATP)较少而且作用广泛，例如，能量代谢、离子通道、蛋白质周转等均受到RPP的调控。然而，关于蛋白质丰度和RPP在越冬两栖动物低代谢状态下的调节作用等信息仍然有限，尤其对世居高原的两栖动物高山倭蛙越冬的调控依旧未知。
近日，德州学院牛永刚团队联合青海大学魏登邦教授、兰州大学陈强教授及加拿大卡尔顿大学Kenneth B. Storey教授等在动物学领域top期刊Zoological Research上发表了题为“Surviving winter on the Qinghai-Xizang Plateau: Extensive reversible protein phosphorylation plays a dominant role in regulating hypometabolism in hibernating Nanorana parkeri”的文章。该研究团队对青藏高原特有两栖动物高山倭蛙的肝脏组织进行了全面的定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，比较了冬季和夏季肝脏中差异表达蛋白质和磷酸化水平显著变化的蛋白质。该研究揭示了广泛的蛋白质磷酸化作为两栖动物过渡到低代谢状态时的一种重要的调节机制。景杰生物为该研究提供了基于TMT的定量蛋白质组学和磷酸化修饰组学技术支持。
1. 蛋白质组学分析和磷酸化蛋白质组学分析
研究者首先选取了冬季和夏季的高山倭蛙的肝脏组织进行了全面的定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，主成分分析（PCA）发现，同一组内的生物样本之间的聚类效果良好，并且夏季和冬季的样品之间呈现明显的分离。蛋白质组学分析发现，夏季和冬季肝脏中共有674个差异表达的蛋白质，其中438个(65%)蛋白质的丰度在冬季上调，236个(35%)蛋白质的丰度在冬季下调。磷酸化蛋白质组分析显示，1638个磷酸化蛋白质的4251个修饰位点磷酸化水平发生显著变化，其中，1555个蛋白质的4147个位点磷酸化水平在冬季明显上调，83个蛋白质的104个位点磷酸化水平在冬季明显下调（图1）。
图1 PCA分析和火山图显示差异表达蛋白质和差异磷酸化蛋白质
2. 差异表达蛋白质和差异磷酸化蛋白质的功能分析
GO富集分析显示，冬眠高山倭蛙肝脏中表达上调的蛋白质富集于生物过程类别中的细胞形态发生调控和细胞连接组装等，分子功能类别中的双链DNA结合、细胞骨架蛋白质结合和DNA结合，以及细胞组分类别中的细胞连接、锚定连接和粘连接合等。而表达下调的蛋白质主要富集于生物过程类别的氧化磷酸化、呼吸电子传递链、细胞呼吸、核糖磷酸代谢过程，分子功能类别中NADH脱氢酶活性、氧化还原酶活性、电子转移活性等，细胞成分类别中呼吸体、呼吸链复合体、线粒体呼吸体和线粒体膜。
KEGG通路富集分析显示，冬眠期表达上调的蛋白质主要富集在紧密连接、血管加压素调控的水重吸收和信号通路，包括Toll和Imd、T细胞受体、Toll样受体、RIG-I样受体、IL-17和Ras信号通路等。表达下调的蛋白质主要富集于代谢相关途径，包括产热、氧化磷酸化、类固醇激素生物合成、视黄醇代谢、初级胆汁酸生物合成、亚油酸代谢、胆固醇代谢和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号转导途径（图2）。
图2 差异表达蛋白质KEGG富集分析圈图
GO富集分析显示，冬眠期磷酸化水平上调的蛋白质富集于生物过程类别中羧酸代谢过程、羧酸生物合成过程、细胞氨基酸代谢过程、高尔基囊泡转运、脂质氧化等，分子功能类别中氧化还原酶活性、mRNA结合和细胞粘附分子结合，以及细胞组分类别中线粒体基质、闰盘和内吞囊泡。KEGG通路富集分析显示，冬眠期磷酸化水平上调的蛋白质主要富集在代谢通路，如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、脂肪酸降解、糖酵解/糖异生和色氨酸代谢、以及低氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、内质网蛋白质加工和蛋白质输出等（图3）。而冬眠期磷酸化水平下调的蛋白质主要在淀粉和蔗糖代谢、细胞色素P450对外源性物质的代谢和致病性大肠杆菌感染等途径富集。
图3 圈图显示磷酸化水平上调的蛋白质KEGG富集分析
3. 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析
PPI网络分析显示，在氧化磷酸化、泛素介导的蛋白质水解、剪接体、脂肪酸延伸和RNA转运等五个主要的连接子网络中，差异表达的蛋白质和磷酸化的蛋白质明显富集（图 4）。在氧化磷酸化过程中，大多数蛋白质的表达量显著下降，但蛋白质的磷酸化水平并没有明显变化。参与泛素介导的蛋白质水解、剪接体、脂肪酸延伸和RNA转运的蛋白质磷酸化水平大幅增加，而蛋白质表达量却没有明显变化，这表明蛋白质磷酸化在这些过程中发挥着重要的调控作用。
图4 差异表达的蛋白质和磷酸化蛋白质的PPI网络
4. 代谢酶活性检测
为了验证蛋白质组学分析结果，研究者选取了四种常见代谢酶（Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、磷酸果糖激酶（PFK）和谷氨酸脱氢酶（GDH）），比较了夏季和冬季肝脏组织中酶活性的差异。结果显示，四种代谢酶的活性在冬季明显低于夏季。冬眠高山倭蛙肝脏中Na+/K+ATP酶和Ca2+ ATP活性分别比夏季个体低34%和75%。此外，冬季PFK和GDH活性比夏季分别低58%和73%（图5）。
图5 夏季和冬季高山倭蛙肝脏中四种代谢酶活性
综上所述，该研究对夏季和冬季高山倭蛙肝脏进行了全面的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。研究表明，参与正常代谢过程（如生长、繁殖、食物获取、伴侣蛋白和抗氧化防御）的各种蛋白质显著下调，而与免疫信号通路相关的蛋白质表达上调。此外，该研究证实RPP是一种重要的调控机制，它在高山倭蛙越冬过程中发挥了广泛的调控作用。RPP调控代谢酶和细胞信号级联的活性，通过介导可变剪接来调控转录过程，抑制能量消耗过程（如离子泵ATP酶和蛋白质周转）。总之，该研究结果有助于揭示高海拔蛙类冬眠的表观遗传调控机制。
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参考文献
Yong-Gang Niu, et al. 2024.Surviving winter on the Qinghai-Xizang Plateau: Extensive reversible protein phosphorylation plays a dominant role in regulating hypometabolism in hibernating Nanorana parkeri. Zool Res.
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