撰文 戚译引
CRISPR 基因编辑技术已经发展出多种形式，然而它们都隐含着同样的风险，那就是脱靶（off-target）——意外编辑了基因组中其他的基因，造成不可预测的后果。在去年底引发巨大争议的贺建奎事件中，许多科学家就表达了同样的担忧：这次编辑究竟有没有发生脱靶？你怎么证明没有脱靶？
学术界早就意识到脱靶问题的存在，但量化评估十分困难。3 月 1 日，中国科学家为主的两个团队在 Science 发表论文，每篇论文只有两页，却揭示了同一个重要的信息：基因编辑有风险，其中单碱基编辑系统（base editor）脱靶尤其严重。
什么是单碱基编辑？
单碱基编辑技术由 CRISPR-Cas9 改进而来。CRISPR 技术的基本原理，就是用 RNA 引导 Cas9 等核酸内切酶对 DNA 上的目标区域进行编辑，可以删除或激活目标基因。核酸内切酶有许多种，Cas9 是其中最早被发现、应用最广泛的，此后被发现的酶还有 Cpf1、Cas12b、Cas13 等。
Cas9 同时对 DNA 的双链进行剪切，形成双链断裂（double strand breaks，DSBs），修复的过程中容易产生新的突变。而单碱基编辑器对 Cas9 进行了改进，并添加了脱氨酶（deaminase），只对 DNA 的一条链进行切割，然后精确地对一个碱基进行修改。
根据目标碱基的不同，单碱基编辑工具可分成两类，一类是胞嘧啶单碱基编辑器（cytidine base editor，CBE），将胞嘧啶（C）转换成胸腺嘧啶（T）；另一类是腺嘌呤碱基编辑器（adenine baseeditor，ABE），将腺嘌呤（A）转换成鸟嘌呤（G）。
单碱基编辑看起来操作更精确，因而被寄予厚望。但这次的两篇 Science 论文对不同编辑技术的脱靶率进行了评估，发现胞嘧啶单碱基编辑器具有极高的风险。
全基因组范围的脱靶效应
中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队用水稻进行实验，发现 CBE 会引发全基因组范围的脱靶效应，其引发的突变数量大约是自然环境下发生突变的两倍（DOI: 10.1126/science.aaw7166）。
高彩霞团队论文。
高彩霞团队借助全基因组测序技术，对三种应用广泛的单碱基编辑工具 BE3、高保真 BE1（HF1-BE3）和 ABE 进行了检验，前两者为。与野生型对照组和 ABE 相比，BE3 和 HF1-BE3（均属于 CBE）引发了数量显著更多的单核苷酸变异（single nucleotide variant，SNV），主要是将基因组中其他部位的胞嘧啶也变成了胸腺嘧啶。
研究还发现，脱靶预测算法 Cas-OFFinder 预测并不准确。在接受 BE3 编辑的植株中，只有 6 处突变发生在预测的 3 个突变部位中；而在接受 HF1-BE3 和 ABE 编辑的植株中，没有一处突变发生在预测的部位中。
GOTI：评估脱靶的新方法
中国科学院神经科学研究所杨辉团队和斯坦福大学 Lars M. Steinmetz 团队合作的研究也得出了相似的结论：Cas9 和 ABE 引发的单核苷酸变异较少，而 CBE 让突变的数量翻了 20 倍（DOI: 10.1126/science.aav9973）。
杨辉团队论文。
该研究的另一亮点在于提出了全新的脱靶评估技术 GOTI（Genome-wide Off-target analysis byTwo-cell embryo Injection）：在小鼠胚胎卵裂球的二细胞期，对其中一个细胞进行基因编辑，并进行荧光蛋白 tdTomato 标记；随后，在胚胎发育的第 14.5 天用流式细胞仪（FACS）将两个细胞的子代进行分离，分别进行测序。
借助 GOTI 技术，科学家第一次能够对脱靶进行全面的量化评估。杨辉团队对 CRISPR-Cas9、BE3 和 ABE7.10 进行了检验，全部 12 组中发生的插入/缺失（indel）数量在 0 到 4 之间，并且没有一个发生在预测的脱靶部位。
实验发现，在经过 BE3 编辑的胚胎中平均发生 283 个 SNV；相比之下，经过 ABE7.0 编辑的胚胎平均发生 10 个 SNV，与自然突变的数量无显著差异。而且，BE3 编辑引发的一些突变发生在原癌基因或抑癌基因上，这进一步提示了可能的致癌风险。
临床应用要谨慎
Science 采访了业内人士对此的看法。哈佛大学化学家、第一代碱基编辑器的发明者刘如谦（David Liu）认为，基因编辑的错误整体上仍属罕见，不太可能对实验室应用造成影响，但足以为那些想要在病人身上进行试验的人敲响警钟。
Cas-OFFinder 的发明者、来自韩国国立首尔大学（Seoul National University）的 Jin-Soo Kim 说：“这两篇论文很有趣，也很重要。现在重要的是找出是哪一种成分引发了其他突变，以及如何减少或消除它。”而麻省总医院（Massachusetts General Hospital）病理学家、刘如谦的合作伙伴 J. Keith Joung 认为，对编辑器中的脱氨酶或其他成分进行改进或许能够减少脱靶效应。
基因编辑疗法被寄予厚望。在治疗镰刀形红细胞贫血症、莱伯先天性黑蒙症方面，相关治疗手段已进入临床试验阶段。而这两项研究进一步提示了基因编辑技术可能存在的风险，再次说明了在投入临床应用前进行充分安全性评估的必要性。
论文信息
【标题】Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice
【作者】Shuai Jin, Yuan Zong, Qiang Gao, Zixu Zhu, Yanpeng Wang, Peng Qin, Chengzhi Liang, Daowen Wang, Jin-Long Qiu, Feng Zhang, Caixia Gao
【期刊】Science
【时间】28 Feb 2019
【DOI】10.1126/science.aaw7166
【摘要】Cytosine and adenine base editors (CBEs and ABEs) are promising new tools for achieving the precise genetic changes required for disease treatment and trait improvement. However, genome-wide and unbiased analyses of their off-target effects in vivo are still lacking. Our whole genome sequencing (WGS) analysis of rice plants treated with BE3, high-fidelity BE3 (HF1-BE3), or ABE revealed that BE3 and HF1-BE3, but not ABE, induce substantial genome-wide off-target mutations, which are mostly the C→T type of single nucleotide variants (SNVs) and appear to be enriched in genic regions. Notably, treatment of rice with BE3 or HF1-BE3 in the absence of single-guide RNA also results in the rise of genome-wide SNVs. Thus, the base editing unit of BE3 or HF1-BE3 needs to be optimized in order to attain high fidelity.
【链接】
论文信息
【标题】Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos
【作者】Erwei Zuo, Yidi Sun, Wu Wei, Tanglong Yuan, Wenqin Ying, Hao Sun, Liyun Yuan, Lars M. Steinmetz, Yixue Li, Hui Yang
【期刊】Science
【时间】28 Feb 2019
【DOI】10.1126/science.aav9973
【摘要】Genome editing holds promise for correcting pathogenic mutations. However, it is difficult to determine off-target effects of editing due to single nucleotide polymorphism in individuals. Here, we developed a method named GOTI (Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection) to detect off-target mutations by editing one blastomere of two-cell mouse embryos using either CRISPR-Cas9 or base editors. Comparison of the whole genome sequences of progeny cells of edited vs. non-edited blastomeres at E14.5 showed that off-target single nucleotide variants (SNVs) were rare in embryos edited by CRISPR-Cas9 or adenine base editor, with a frequency close to the spontaneous mutation rate. In contrast, cytosine base editing induced SNVs with over 20-fold higher frequencies, requiring a solution to address its fidelity.
【链接】
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